art_21
Notre Ministre de l’Agriculture, de la Viticulture et du Développement rural et Notre Ministre de la Justice sont chargés, chacun en ce qui le concerne, de l’exécution du présent règlement qui sera publié au Mémorial.
Annexe A
I.
Troupeau bovin officiellement indemne de tuberculose
Aux fins de la présente section I, on entend par «bovins»: tous les animaux bovins, à l’exception des animaux participant à des manifestations culturelles ou sportives.
1.Un troupeau bovin est officiellement indemne de tuberculose si:a)tous les animaux sont exempts de manifestations cliniques de tuberculose;
b)tous les bovins âgés de plus de six semaines ont présenté une réaction négative à au moins deux intradermotuberculinations officielles pratiquées selon les dispositions de l’annexe B, la première six mois après la fin des opérations d’assainissement du troupeau et la seconde six mois après la première, ou, si le troupeau se compose uniquement d’animaux originaires de troupeaux officiellement indemnes de tuberculose, la première est pratiquée au moins soixante jours après le regroupement et la seconde n’est pas nécessaire;
c) à la suite du premier test visé au point b), aucun bovin âgé de plus de six semaines n’a été introduit dans le troupeau s’il n’a pas présenté de réaction négative à une intradermo-tuberculination effectuée et analysée selon les dispositions de l’annexe B et pratiquée dans les trente jours précédant ou dans les trente jours suivant la date de son introduction dans le troupeau; dans ce dernier cas, l’animal (les animaux) doit (doivent) être isolé(s) physiquement des autres animaux du troupeau de manière à éviter tout contact direct ou indirect avec les autres animaux jusqu’à ce que la preuve d’une réaction négative soit apportée.Toutefois, pour les mouvements d’animaux sur son territoire, l’autorité compétente peut ne pas exiger ce test pour les animaux provenant d’un troupeau officiellement indemne de tuberculose, sauf s’il s’agit d’un Etat membre dans lequel l’autorité compétente exige ce test à la date du 1er janvier 1998 – et ce, jusqu’à l’obtention du statut de région officiellement indemne de tuberculose – pour les animaux faisant l’objet d’échanges entre troupeaux participant à un réseau au sens de l’article 14.
2.Un troupeau bovin conserve son statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose si:a)les conditions exposées aux points 1 a) et 1 c) continuent de s’appliquer;
b)tous les animaux introduits dans l’exploitation proviennent de troupeaux ayant le statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose;
c)tous les animaux de l’exploitation, à l’exception des veaux âgés de moins de six semaines et nés dans cette exploitation, sont soumis à une tuberculination de routine conformément aux dispositions de l’annexe B à un rythme annuel.Toutefois, l’autorité compétente d’un Etat membre peut, pour l’Etat membre ou la partie de l’Etat membre où la totalité des troupeaux bovins est soumise à un programme officiel de lutte contre la tuberculose, modifier comme suit la fréquence des tests de routine:
–si la moyenne – déterminée le 31 décembre de chaque année – des pourcentages annuels des troupeaux bovins dont il est confirmé qu’ils ont été infectés de tuberculose n’est pas supérieure à 1% de la totalité des troupeaux de la zone déterminée au cours des deux plus récentes périodes de contrôle se succédant à un rythme annuel, l’intervalle entre les tests de routine pratiqués sur les troupeaux peut être porté à deux ans et les mâles destinés à l’engraissement au sein d’une unité épidémiologique isolée peuvent être dispensés des tests tuberculiniques pour autant qu’ils proviennent d’un troupeau officiellement indemne de tuberculose et que l’autorité compétente garantisse que les mâles destinés à l’engraissement ne seront pas utilisés pour l’élevage et seront directement acheminés à l’abattage,
–si la moyenne – déterminée le 31 décembre de chaque année – des pourcentages annuels des troupeaux bovins dont il est confirmé qu’ils ont été infectés de tuberculose n’est pas supérieure à 0,2% de la totalité des troupeaux de la zone déterminée au cours des deux plus récentes périodes de contrôle se succédant à deux ans d’intervalle, l’intervalle entre les tests de routine et/ou l’âge auquel les animaux devont être soumis à ces tests peut être porté à vingt-quatre mois,
–si la moyenne – déterminée à la date du 31 décembre de chaque année – des pourcentages annuels des troupeaux bovins dont il est confirmé qu’ils ont été infectés de tuberculose n’est pas supérieure à 0,1% de la totalité de la zone déterminée au cours des deux plus récentes périodes de contrôle se succédant à trois ans d’intervalle, l’intervalle entre les tests de routine peut être porté à quatre ans ou, pour autant que les conditions suivantes soient remplies, l’autorité compétente peut dispenser de l’obligation de soumettre les troupeaux à une tuberculination, à condition que:1)avant d’être introduits dans un troupeau, tous les bovins subissent avec résultat négatif une intradermo-tuberculinationou
2)tous les bovins abattus fassent l’objet d’une recherche des lésions de tuberculose et que celles-ci soient soumises à un examen histopathologique et bactériologique pour la mise en évidence de la tuberculose.L’autorité compétente peut également augmenter la fréquence des tests tuberculiniques en ce qui concerne l’Etat membre ou la partie de l’Etat membre concerné(e) si l’ampleur de la maladie a augmenté.
3.A. Le statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose est suspendu si:a)les conditions exposées au point 2 ne sont plus remplies
ou
b) un animal, voire plusieurs, est ou sont considéré(s) avoir présenté une réaction positive à une tuberculination, ou si un cas suspect de tuberculose a été constaté lors de l’inspection post mortem. Lorsqu’on estime qu’un animal réagit de manière positive, il est éliminé du troupeau et abattu. Des tests post mortem ainsi que des analyses de laboratoire et des analyses épidémiologiques appropriés sont effectués sur l’animal présentant une réaction positive ou sur la carcasse de l’animal suspect. Le statut du troupeau demeure suspendu jusqu’à ce que tous les examens de laboratoire soient terminés. Si la présence de tuberculose n’est pas confirmée, la suppression du statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose peut être levée à la suite d’un test pratiqué sur tous les animaux âgés de plus de six semaines et ayant donné des résultats négatifs au moins quarante-deux jours après l’élimination de l’animal ayant présenté une réaction positive
ou
c)le troupeau comprend des animaux dont le statut est indéterminé, tel que décrit à l’annexe B. Dans ce cas, le statut du troupeau reste suspendu jusqu’à ce que le statut des animaux soit clarifié. Ces animaux doivent être isolés des autres animaux du troupeau jusqu’à ce que leur statut soit clarifié, soit par un nouveau test quarante-deux jours plus tard, soit par des tests post mortem et des analyses de laboratoire;
d)toutefois, par dérogation aux exigences prévues au point c), dans un État membre où l’autorité compétente pratique des tests de routine sur les troupeaux au moyen de la tuberculination de comparaison décrite à l’annexe B, et dans le cas d’un troupeau dans lequel aucun animal présentant une réaction confirmée n’a été signalé pendant au moins trois ans, l’autorité compétente peut décider de ne pas limiter les mouvements des autres animaux du troupeau, à condition que le statut de tout animal présentant une réaction douteuse soit déterminé par un nouveau test quarante-deux jours plus tard et qu’aucun animal de l’exploitation ne puisse participer aux échanges intracommunautaires tant que le statut de tout animal présentant une réaction douteuse n’a pas été déterminé. Si, lors du nouveau test, un animal présente une réaction positive ou continue de présenter une réaction douteuse, les conditions du point b) s’appliquent. Si la présence de la maladie est confirmée par la suite, tous les animaux quittant l’exploitation à partir du moment où le dernier test pratiqué sur le troupeau a été satisfaisant doivent être localisés et faire l’objet d’un test.
3.B. Le statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose est retiré si la présence de la tuberculose est confirmée par l’isolement de M bovis lors d’examens en laboratoire.L’autorité compétente peut retirer ce statut si:
a) les conditions exposées au point 2 ne sont plus remplies
ou
b)des lésions caractéristiques de la tuberculose sont constatées lors des examens post mortem
ou
c)une enquête épidémiologique conclut à la probabilité d’une infection
ou
d)pour toute autre raison jugée nécessaire pour les besoins du contrôle de la tuberculose bovine. La localisation et le contrôle de tout troupeau considéré comme étant affecté par la tuberculose sont effectués par l’autorité compétente. Le statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose reste suspendu jusqu’à ce que le nettoyage et la désinfection des locaux et des outils aient été effectués et jusqu’à ce que tous les animaux âgés de plus de six semaines aient présenté une réaction négative à au moins deux tuberculinations consécutives, la première ayant lieu soixante jours au moins et la seconde quatre mois au moins et douze mois au plus après l’élimination du dernier animal ayant présenté une réaction positive.
4. Sur la base des informations fournies conformément à l’article 8, un Etat membre ou une partie du territoire d’un Etat membre peut être déclaré(e) officiellement indemne de tuberculose conformément à la procédure du Comité vétérinaire permanent s’ils remplissent les conditions suivantes:a)le pourcentage des troupeaux bovins dont il est confirmé qu’ils ont été infectés de tuberculose n’a pas été supérieur à 0,1% par an pendant six années consécutives et au moins 99,9% des troupeaux ont été déclarés officiellement indemnes de tuberculose chaque année au cours des six dernières années, le calcul de ce dernier pourcentage devant être effectué le 31 décembre de chaque année;
b) chaque bovin est identifié conformément à la législation communautaire;
c) tous les bovins abattus sont soumis à une inspection post mortem officielle;
d)les procédures de suspension et de retrait du statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose sont respectées.
5.L’Etat membre ou la partie du territoire de l’Etat membre conserve son statut de zone officiellement indemne de tuberculose si les conditions fixées aux points 4 a) à d) continuent à être remplies. Toutefois, s’il est avéré qu’un changement important est intervenu dans la situation en matière de tuberculose dans un Etat membre ou dans une partie du territoire d’un Etat membre ayant été reconnu(e) officiellement indemne de tuberculose, la Commission peut, conformément à la procédure du Comité vétérinaire permanent, décider de suspendre ou de révoquer le statut jusqu’à ce que les conditions fixées par la décision soient remplies.
II.
Troupeau bovin indemne de brucellose et officiellement indemne de brucellose
Aux fins de la présente section, on entend par «bovins»: tous les animaux bovins, à l’exception des mâles destinés à l’engraissement pour autant qu’ils proviennent d’un troupeau officiellement indemne de brucellose et que l’autorité compétente garantisse que les mâles destinés à l’engraissement ne seront pas utilisés pour l’élevage et seront directement acheminés à l’abattage.
1.Un troupeau bovin est officiellement indemne de brucellose:a)s’il ne comprend aucun bovin vacciné contre la brucellose, à moins qu’il ne s’agisse de femelles ayant été vaccinées depuis au moins trois ans;
b) si tous les bovins sont exempts de signes cliniques de brucellose depuis au moins six mois;
c) si tous les bovins âgés de plus de douze mois ont été soumis à l’une des séries de tests suivantes, avec résultat négatif conformément aux dispositions de l’annexe C:i) deux épreuves sérologiques, telles que décrites au point 10, pratiquées à des intervalles de trois mois au moins et de douze mois au plus;
ii)trois épreuves sur échantillons de lait à des intervalles de trois mois suivies d’une épreuve sérologique telle que décrite au point 10, pratiquée au moins six semaines plus tard;
d) si tout bovin introduit dans le troupeau provient d’un troupeau ayant le statut de troupeau officiellement indemne de brucellose et, dans le cas de bovins âgés de plus de douze mois, s’il a présenté un titre brucellique inférieur à 30 unités internationales (UI) agglutinantes par millilitre lors d’une épreuve de séro-agglutination pratiquée selon les dispositions de l’annexe C ou s’il a présenté une réaction négative lors de tout autre test approuvé selon la procédure du Comité vétérinaire permanent, dans les trente jours ayant précédé ou suivi la date de son introduction dans le troupeau; dans ce dernier cas, l’animal (les animaux) doit (doivent) être isolé(s) physiquement des autres animaux du troupeau de manière à éviter un contact direct avec les autres animaux jusqu’à ce que la preuve d’une réaction négative soit apportée.
2.Un troupeau bovin conserve son statut de troupeau officiellement indemne de brucellose si:a)l’une des séries d’épreuves suivantes est effectuée chaque année avec des résultats négatifs conformément aux dispositions de l’annexe C:i)trois épreuves de l’anneau sur le lait pratiquées à des intervalles d’au moins trois mois;
ii)trois épreuves ELISA sur le lait effectuées à des intervalles d’au moins trois mois;
iii) deux épreuves de l’anneau sur le lait effectuées à un intervalle d’au moins trois mois suivies d’une épreuve sérologique visée au point 10 pratiquée au moins six semaines plus tard;
iv) deux épreuves ELISA sur le lait effectuées à un intervalle d’au moins trois mois suivies d’une épreuve sérologique visée au point 10 pratiquée au moins six semaines plus tard;
v)deux épreuves sérologiques effectuées à un intervalle de trois mois au moins et de douze mois au plus.
Toutefois, l’autorité compétente d’un Etat membre peut, pour l’Etat membre ou la partie du territoire de l’Etat membre qui n’est pas officiellement indemne de brucellose, mais dont tous les troupeaux bovins sont soumis à un programme officiel de lutte contre la brucellose, modifier comme suit la fréquence des contrôles de routine:
–lorsque le pourcentage des troupeaux bovins infectés n’est pas supérieur à 1%, il suffit de procéder annuellement à deux épreuves de l’anneau sur le lait ou à deux épreuves ELISA sur le lait à un intervalle d’au moins trois mois, ou à une épreuve sérologique,
–lorsque au moins 99,8% des troupeaux bovins sont reconnus officiellement indemnes de brucellose depuis quatre ans au minimum, l’intervalle entre les contrôles peut être porté à deux ans si tous les animaux âgés de plus de douze mois font l’objet de tests, ou ceux-ci peuvent être limités aux animaux âgés de plus de vingt-quatre mois si les troupeaux continuent de faire l’objet de tests chaque année. Les contrôles doivent être effectués à l’aide de l’une des épreuves sérologiques décrites au point 10;
b)tous les bovins introduits dans le troupeau proviennent de troupeaux officiellement indemnes de brucellose et, dans le cas de bovins âgés de plus de douze mois, s’ils ont présenté un titre brucellique inférieur à 30 UI agglutinantes par millilitre lors d’une épreuve de séro-agglutination pratiquée selon les dispositions de l’annexe C ou s’ils ont présenté une réaction négative lors de tout autre test approuvé selon la procédure du Comité vétérinaire permanent dans les trente jours ayant précédé ou suivi l’introduction dans le troupeau; dans ce dernier cas, l’animal (les animaux) doit (doivent) être isolé(s) physiquement des autres animaux du troupeau de manière à éviter un contact direct ou indirect avec les autres animaux jusqu’à ce que la preuve d’une réaction négative soit apportée.Toutefois, le test visé au point b) peut ne pas être exigé dans les Etats membres ou les régions des Etats membres où, depuis deux ans au moins, le pourcentage de troupeaux bovins infectés de brucellose n’est pas supérieur à 0,2% et si l’animal provient d’un troupeau bovin officiellement indemne de brucellose situé dans cet Etat membre ou dans cette région et n’est pas entré en contact avec des bovins de statut inférieur à l’occasion de son transport;
c)par dérogation au point b), les bovins provenant d’un troupeau bovin indemne de brucellose peuvent être introduits dans un troupeau officiellement indemne de brucellose s’ils sont âgés d’au moins dix-huit mois et vaccinés contre la brucellose, le vaccin ayant été pratiqué plus d’un an auparavant.
Ces animaux doivent avoir présenté, dans les trente jours précédant l’introduction, un titre brucellique inférieur à 30 UI agglutinantes par millilitre et un résultat négatif au test de fixation du complément ou à un autre test approuvé selon la procédure du Comité vétérinaire permanent.
Si, toutefois, conformément aux dispositions de l’alinéa précédent, une femelle bovine provenant d’un troupeau indemne de brucellose est introduite dans un troupeau officiellement indemne de brucellose, ce dernier est considéré comme indemne de brucellose pendant deux ans à partir de la date d’introduction du dernier animal vacciné.
3.A. Le statut de troupeau officiellement indemne de brucellose est suspendu si: a)les conditions exposées aux points 1 et 2 ne sont plus remplies
ou
b)sur la base de résultats de tests effectués en laboratoire ou pour des raisons cliniques, on suspecte la présence de brucellose chez un ou plusieurs bovins et si les animaux suspects ont été abattus ou isolés de manière à éviter tout contact direct ou indirect avec les autres animaux.Lorsque les animaux ont été abattus et ne peuvent donc plus être soumis à des tests, la suspension peut être levée si deux séro-agglutinations effectuées conformément aux dispositions de l’annexe C sur tous les bovins du troupeau âgés du plus de douze mois donnent un titre inférieur à 30 UI agglutinantes par millilitre. Le premier test est effectué au moins trente jours après l’élimination de l’animal et le second au moins soixante jours plus tard.
Lorsque l’animal a été isolé des autres animaux du troupeau, il peut être réintroduit dans le troupeau et le statut de celui-ci peut être rétabli à la suite:
a)d’une épreuve de séro-agglutination qui a donné un titre inférieur à 30 UI agglutinantes par millilitre et si un test de fixation du complément donne un résultat négatif
ou
b)de toute autre combinaison de tests approuvée selon la procédure du Comité vétérinaire permanent, qui a donné un résultat négatif.
3.B. Le statut de troupeau officiellement indemne de brucellose est retiré si les résultats de tests effectués en laboratoire ou d’analyses épidémiologiques ont confirmé la présence d’une infection brucellique dans le troupeau.Le statut de ce troupeau ne peut être rétabli avant que soit tous les bovins présents dans le troupeau au moment de la première manifestation de la maladie aient été abattus, soit tout le troupeau ait été soumis à un test de contrôle et tous les animaux âgés de plus de douze mois aient présenté un résultat négatif à deux tests consécutifs effectués à des intervalles de soixante jours, le premier intervenant trente jours au moins après l’élimination de l’animal (des animaux) ayant présenté une réaction positive. Dans le cas de femelles bovines gravides au moment de la première manifestation de la maladie, le dernier test doit être effectué au moins vingt et un jours après que le dernier animal gravide au moment de la première manifestation de la maladie a mis bas.
4.Un troupeau bovin est indemne de brucellose s’il remplit les conditions fixées aux points 1 b) et 1 c), lorsqu’une vaccination a été effectuée, si: i) les femelles bovines ont été vaccinées:– avant l’âge de six mois à l’aide du vaccin vivant buck 19 ou
–avant l’âge de quinze mois à l’aide du vaccin tué adjuvé 45/20 contrôlé et approuvé
ou
–avec d’autres vaccins agréés selon la procédure du Comité vétérinaire permanent;
ii)les bovins âgés de moins de trente mois qui ont été vaccinés à l’aide du vaccin vivant buck 19 peuvent présenter un titre brucellique supérieur à 30 UI, mais inférieur à 80 UI agglutinantes par millilitre, pour autant qu’ils présentent, lors de la réaction de fixation du complément, un titre inférieur à 30 unités CEE s’il s’agit de femelles vaccinées depuis moins de douze mois ou un titre inférieur à 20 unités CEE dans tous les autres cas.
5.Un troupeau bovin conserve le statut de troupeau indemne de brucellose:i) s’il est soumis à l’une des séries d’épreuves énumérées au point 2 a);
ii)si les bovins introduits dans le troupeau satisfont aux exigences prévues au point 2 b) ou:–proviennent de troupeaux ayant le statut de troupeaux indemnes de brucellose et, lorsqu’il s’agit de bovins âgés de plus de douze mois, ont présenté dans les trente jours avant l’introduction dans le troupeau ou placés en isolement après l’introduction un titre inférieur à 30 Ul agglutinantes par millilitre lors d’une épreuve de séro-agglutination et une réaction de fixation du complément négative conformément aux dispositions de l’annexe C ou
–proviennent de troupeaux ayant le statut de troupeaux indemnes de brucellose, sont âgés de moins de trente mois et ont été vaccinés à l’aide du vaccin vivant buck 19 s’ils présentent un titre brucellique supérieur à 30 Ul, mais inférieur à 80 Ul agglutinantes par millilitre, pour autant qu’ils présentent, lors de la réaction de la fixation du complément, un titre inférieur à 30 unités CEE s’il s’agit de femelles vaccinées depuis moins de douze mois ou un titre inférieur à 20 unités CEE dans tous les autres cas.
6.A. Le statut de troupeau indemne de brucellose est suspendu si: a)les conditions exposées aux points 4 et 5 n’ont pas été remplies ou
b)sur la base des résultats de tests effectués en laboratoire ou pour des raisons cliniques, on suspecte la présence de brucellose chez un ou plusieurs bovins âgés de plus de trente mois et l’animal (les animaux) suspect(s) a (ont) été abattu(s) ou isolé(s) de manière à éviter tout contact direct ou indirect avec les autres animaux. Lorsque l’animal a été isolé, il peut être réintroduit dans le troupeau et le statut de celui-ci peut être rétabli si, par la suite, une épreuve de séroagglutination donne un titre inférieur à 30 Ul agglutinantes par millilitre et si un test de fixation du complément, ou tout autre test approuvé selon la procédure du Comité vétérinaire permanent, donne un résultat négatif.
Lorsque les animaux ont été abattus et ne peuvent donc plus être soumis à des tests, la suspension peut être levée si deux séro-agglutinations, effectuées conformément aux dispositions de l’annexe C sur tous les bovins de l’exploitation âgés de plus de douze mois, donnent un titre inférieur à 30 Ul agglutinantes par millilitre. Le premier test est effectué au moins trente jours après l’élimination de l’animal, et le second test au moins soixante jours plus tard. Si les animaux à tester visés aux deux alinéas précédents sont âgés de moins de trente mois et ont été vaccinés à l’aide d’un vaccin vivant buck 19, ils peuvent être considérés comme négatifs si le résultat d’une épreuve de séro-agglutination est supérieur à 30 Ul, mais inférieur à 80 Ul agglutinantes par millilitre, pour autant qu’ils présentent, lors de la fixation du complément, un résultat inférieur à 30 unités CEE s’il s’agit de femelles vaccinées depuis moins de douze mois ou inférieur à 20 unités CEE dans tous les autres cas.
6.B. Le statut de troupeau indemne de brucellose est retiré si les résultats de tests effectués en laboratoire ou d’analyses épidémiologiques ont confirmé la présence d’une infection brucellique dans le troupeau. Le statut de ce troupeau ne peut être rétabli avant que soit tous les bovins présents dans le troupeau au moment de la première manifestation de la maladie aient été abattus, soit tout le troupeau ait été soumis à un test de contrôle et tous les animaux non vaccinés âgés de plus de douze mois aient présenté un résultat négatif à deux tests consécutifs effectués à soixante jours d’intervalle, le premier intervenant trente jours au moins après l’élimination de l’animal (des animaux) ayant présenté une réaction positive.Si tous les animaux à tester visés à l’alinéa précédent sont âgés de moins de trente mois et ont été vaccinés à l’aide d’un vaccin vivant buck 19, ils peuvent être considérés comme négatifs s’ils présentent un titre brucellique supérieur à 30 Ul, mais inférieur à 80 Ul agglutinantes par millilitre, pour autant qu’ils présentent, lors de la fixation du complément, un titre inférieur à 30 unités CEE s’il s’agit de femelles vaccinées depuis moins de douze mois ou un titre inférieur à 20 unités CEE dans tous les autres cas.
Dans le cas de femelles bovines gravides au moment de la première manifestation de la maladie, le dernier test doit être effectué au moins vingt et un jours après que le dernier animal gravide au moment de la première manifestation de la maladie a mis bas.
7.Un Etat membre ou une région d’un Etat membre peut être déclaré(e) officiellement indemne de brucellose conformément à la procédure du Comité vétérinaire permanent si les conditions suivantes sont remplies:a)aucun cas d’avortement dû à une infection brucellique ni aucune isolation de B. abortus n’ont été enregistrés depuis au moins trois ans et au moins 99,8% des troupeaux ont obtenu le statut d’officiellement indemnes de brucellose chaque année au cours des cinq dernières années, le calcul de ce pourcentage devant être effectué le 31 décembre de chaque année. Toutefois, lorsque l’autorité compétente adopte une politique d’abattage de l’ensemble du troupeau, elle pourra ne pas tenir compte, lors de ce calcul, des incidents isolés décelés lors d’une enquête épidémiologique et qui seraient dus à l’introduction d’animaux provenant de l’extérieur de l’Etat membre ou d’une partie de l’Etat membre et de cheptels d’une partie de cet Etat membre dont le statut a été retiré ou suspendu pour des raisons autres que la suspicion de brucellose, pour autant que l’autorité centrale compétente de l’Etat membre concerné par ces incidents procède à leur recensement annuel pour les communiquer à la Commission, conformément à l’article 8, paragraphe 2 et
b)chaque bovin est identifié conformément à la législation communautaire et
c) la notification des cas d’avortement est obligatoire et ces derniers font l’objet d’une enquête par l’autorité compétente.
8.Sous réserve du point 9, un Etat membre ou une région d’un Etat membre déclaré(e) officiellement indemne de brucellose conserve ce statut si: a) les conditions fixées aux points 7 a) et 7 b) continuent à être remplies et que la notification de cas d’avortement suspectés d’être dus à la brucellose est obligatoire et que ces derniers font l’objet d’une enquête par l’autorité compétente;
b)chaque année, au cours des cinq premières années qui suivent l’obtention du statut, tous les bovins âgés de plus de vingt-quatre mois, dans 20 % au moins des troupeaux, ont fait l’objet de tests et ont présenté une réaction négative lors d’une épreuve sérologique effectuée conformément à l’annexe C, ou, dans le cas des troupeaux laitiers, par un examen d’échantillons de lait conformément à l’annexe C;
c)tout bovin dont on suspecte qu’il est infecté de brucellose est signalé à l’autorité compétente et soumis à une enquête épidémiologique officielle ayant pour objet de détecter la brucellose comprenant au moins deux épreuves sérologiques sur le sang, parmi lesquelles l’épreuve de fixation du complément, ainsi qu’une analyse microbiologique d’échantillons appropriés;
d) pendant la période suspecte, qui se prolonge jusqu’à ce que les tests prévus au point c) aient donné des résultats négatifs, le statut de troupeau officiellement indemne de brucellose du troupeau d’origine ou de transit du bovin suspect et des troupeaux présentant avec lui un lien épidémiologique est suspendu;
e) dans le cas d’un foyer de brucellose évolutive, tous les bovins ont été abattus. Les animaux des espèces sensibles restants seront soumis aux tests appropriés; les locaux et le matériel seront nettoyés et désinfectés.
9.Un Etat membre ou une région d’un Etat membre déclaré(e) officiellement indemne de brucellose signale à la Commission tous les cas de brucellose qu’elle enregistre. S’il est avéré qu’un changement important est intervenu dans la situation concernant la brucellose dans un Etat membre ou dans une partie d’un Etat membre ayant été reconnu(e) officiellement indemne de brucellose, la Commission peut, conformément à la procédure du Comité vétérinaire permanent, proposer que le statut soit suspendu ou révoqué, jusqu’à ce que les conditions fixées par la décision aient été remplies.
10. Aux fins de la présente section II, on entend par «épreuve sérologique»: une épreuve de séro-agglutination, une épreuve à l’antigène brucellique tamponné, une épreuve de fixation du complément, une épreuve de plasmoagglutination, une épreuve de l’anneau sur plasma, une épreuve de micro-agglutination ou une épreuve ELISA individuelle sur le sang, telles que décrites à l’annexe C. Tout autre test diagnostique approuvé selon la proécédure du Comité vétérinaire permanent et décrit à l’annexe C sera également accepté aux fins de la présente section II. On entend par «épreuve sur le lait»: une épreuve de l’anneau sur le lait ou une épreuve ELISA sur le lait conformément à l’annexe C.
ANNEXE B
TUBERCULOSE
1. IDENTIFICATION DE L’AGENT
La présence du Mycobacterium bovis
(M. bovis), agent de la tuberculose bovine, sur des échantillons cliniques et post mortem peut être établie par l’examen de frottis colorés ou de techniques d’immunoperoxydase et confirmée par culture de l’organisme sur un milieu d’isolement primaire.
Le tissu pathologique pour la confirmation de la présence du M. bovis doit être prélevé sur des ganglions anormaux et des organes parenchymateux tels que les poumons, le foie, la rate, etc. Dans les cas où l’animal ne présente pas de lésions pathologiques, des échantillons devront être prélevés sur les ganglions rétropharyngiens, les ganglions pulmonaires, les ganglions médiastinaux, les ganglions lymphatiques supramammaires, les ganglions maxillaires et certains ganglions mésantériques et hépatiques, pour procéder à leur examen et à leur culture.
L’identification d’isolats peut habituellement se faire en déterminant les propriétés biochimiques et les spécificités de culture. La réaction en chaîne à la polymérase (PCR) peut aussi être utilisée pour détecter le complexe de tuberculose M. tuberculosis. Les techniques d’analyse de l’ADN peuvent se révéler plus rapides et plus fiables que les méthodes biochimiques pour différencier le Mycobacterium bovis des autres membres du complexe de tuberculose M. tuberculosis. Les empreintes génétiques permettent d’établir la différence entre les différentes souches du Mycobacterium bovis et elles permettront de décrire les modèles de l’origine ainsi que les modes de transmission et de contagion du Mycobacterium bovis.
Les techniques et les moyens utilisés, leur standardisation et l’interprétation des résultats doivent être conformes aux indications figurant au chapitre 2.3.1 (brucellose bovine) du manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins (4e édition, 2000) de l’OIE.
2. TEST CUTANE A LA TUBERCULINE
Les dérivés protéiques purifiés de la tuberculine qui remplissent les conditions établies au point 2.1 seront utilisés pour réaliser le test cutané officiel à la tuberculine en suivant les procédures mentionnées au point 2.2.
2.1. Normes applicables à la tuberculine (bovine et aviaire)
2.1.1. Définition
Le dérivé protéique purifié (tuberculine PPD, bovine ou aviaire) est une préparation obtenue en faisant subir un traitement thermique à des produits de croissance et de lyse du Mycobacterium bovis et du Micobacterium avium (selon le cas) capables de révéler une hypersensibilité retardée chez un animal sensibilisé à des micro-organismes de la même espèce.
2.1.2. Production
Elle est obtenue à partir de fractions solubles dans l’eau préparées en chauffant à la vapeur lâchée librement, puis en filtrant des cultures de M. bovis et M. avium (selon le cas) élevées dans un milieu synthétique liquide. La fraction active du filtrat, composée essentiellement de protéines, est isolée par précipitation, lavée et fait l’objet d’une nouvelle dissolution. On peut ajouter un produit de protection antimicrobien qui ne provoque pas de fausses réactions positives comme le phénol. La préparation stérile finale, exempte de mycobactéries, est répartie dans des conditions d’asepsie, dans des récipents en verre inviolables qui sont ensuite fermés afin d’éviter toute contamination. La préparation peut être lyophilisée.
2.1.3. Identification du produit
Injecter par voie intradermique plusieurs doses calibrées à différents endroits sur des cobayes albinos correctement sensibilisés, ne pesant pas moins de 250 grammes chacun. Après 24 à 28 heures, des réactions apparaissent sous forme d’œdèmes avec érythème, avec ou sans nécrose aux points d’injection. L’ampleur et la gravité des réactions varient selon la dose injectée. Les cobayes insensibilisés ne présentent aucune réaction à des injections de ce type.
2.1.4. Tests
2.1.4.1. pH: le pH est de 6,5 à 7,5
2.1.4.2. Phénol: si la préparation à examiner contient du phénol, sa concentration ne doit pas être supérieure à 5 g/l.
2.1.4.3. Effet sensibilisant: utiliser un groupe de 3 cobayes qui n’ont été traités avec aucun matériel interférant avec le test. A trois reprises, à cinq jours d’intervalle, injecter par voie intradermique à chaque cobaye une dose de la préparation à examiner équivalente à 500 UI dans 0,1 ml. Quinze à vingt et un jours après la première injection, injecter la même dose (500 UI) par voie intradermique à ces animaux et à un groupe de contrôle de trois cobayes de même poids et n’ayant pas reçu au préalable d’injections de tuberculine. 24 à 48 heures après les dernières injections, les réactions des deux groupes ne présentent pas de grandes différences.
2.1.4.4. Toxicité: utiliser deux cobayes, pesant au moins 250 grammes chacun et n’ayant été traités au préalable avec aucun matériel interférant avec le test. Injecter par voie sous-cutanée à chaque cobaye 0,5 ml de la préparation à examiner. Observer les animaux pendant sept jours. Pendant la période d’observation, il ne se produit aucun effet anormal.
2.1.4.5. Stérilité: il convient d’effectuer le test de stérilité prescrit par la monographie sur les vaccins à usage vétérinaire, 4e édition (2002), de la Pharmacopée européenne.
2.1.5. Activité
On détermine l’activité du dérivé protéique purifié de la tuberculine (bovine et aviaire) en comparant les réactions produites chez les cobayes sensibilisés par l’injection intradermique d’une série de dilutions de la préparation à examiner à celles produites par les concentrations connues d’une préparation de référence de dérivé protéique purifié de la tuberculine (bovine et aviaire, selon le cas) mesurée en unités internationales. Pour tester l’activité, sensibiliser au moins neuf cobayes albinos, de 400 à 600 grammes chacun, par une injection intramusculaire profonde de 0,0001 mg de masse humide de M. bovis vivant de souche AN5, en suspension dans 0,5 ml d’une solution de 9 g/l de chlorure de sodium R pour la tuberculine bovine, ou une dose appropriée de M. avium inactivé ou vivant, pour la tuberculine aviaire. Quatre semaines au moins après la sensibilisation des cobayes, raser les flances des animaux afin de disposer de l’espace nécessaire pour un maximum de quatre points d’injection de chaque côté. Préparer des dilutions de la préparation à examiner et de la préparation de référence en utilisant une solution saline isotonique tamponée de phosphates (pH entre 6,5 et 7,5) contenant 0,005 g/l de polysorbate 80 R. Utiliser au moins trois doses de la préparation de référence et autant de la préparation à examiner. Choisir les doses de sorte que les lésions produites aient un diamètre de 8 à 25 mm. Répartir les dilutions de manière aléatoire sur les points en utilisant un carré latin. Injecter chaque dose par voie intradermique dans un volume constant de 0,1 ou 0,2 ml. Après 24 à 48 heures, mesurer les diamètres des lésions et calculer le résultat du test, en utilisant les méthodes statistiques habituelles et en se basant sur l’hypothèse que les diamètres des lésions sont directement proportionnels au logarithme de la concentration des tuberculines.
Le test ne sera valable que si les limites d’erreur (P = 0,95) sont supérieures à 50% et inférieures à 200% de l’activité estimée. L’activité estimée est supérieure à 66% et inférieure à 150% de la puissance déclarée de la tuberculine bovine. L’activité calculée sera supérieure à 75% et inférieure à 133% de la puissance déclarée de la tuberculine aviaire. L’activité déclarée sera supérieure à 20 000 UI/ml pour les deux tuberculines (bovine et aviaire).
2.1.6. Stockage
Stocker à l’abri de la lumière, à une température de 5 ± 3 °C.
2.1.7. Etiquetage
L’étiquette doit indiquer:
– l’activité en unités internationales par millilitre,
– le nom et la quantité des substances ajoutées,
– pour les préparations lyophilisées:– le nom et le volume du liquide de reconstitution à ajouter,
– que le produit doit être utilisé immédiatement après reconstitution.
2.2. Procédures de test
2.2.1. Les tests suivants sont reconnus comme tuberculinations intradermiques officielles:
– le test intradermique simple: ce test requiert une seule injection de tuberculine bovine,
–le test intradermique comparatif: ce test requiert l’administration simultanée d’une injection de tuberculine bovine et d’une injection de tuberculine aviaire.
2.2.2. La dose de tuberculine injectée sera:
– égale ou supérieure à 2 000 UI de tuberculine bovine,
– égale ou supérieure à 2 000 UI de tuberculine aviaire.
2.2.3. Le volume de chaque injection ne dépassera pas 0,2 ml.
2.2.4. Les tests de tuberculine seront réalisés en injectant la tuberculine dans la peau du cou. Les points d’injection se situeront à limite des tiers antérieur et médian du cou. Lorsque les deux types de tuberculine, bovine et aviaire, seront injectés à un même animal, le point d’injection de la tuberculine aviaire sera situé à 10 cm de la crête du cou et celui de la tuberculine bovine, 12,5 cm plus bas, sur une ligne à peu près parallèle à la ligne de l’épaule ou sur les côtés du cou; sur les animaux jeunes où il n’y a pas d’espace pour séparer suffisamment les points d’injection sur un côté du cou, on administrera une injection de chaque côté du cou, à des points identiques, au centre du tiers médian du cou.
2.2.5. La technique de tuberculination et l’interprétation des réactions seront les suivantes:
2.2.5.1. Technique
Les points d’injection seront poinçonnés et nettoyés. Dans chaque zone de peau poinçonnée, on prendra un pli de peau entre le pouce et l’index, on le mesurera à l’aide d’un compas et on notera le résultat. La dose de tuberculine sera ensuite injectée par une méthode garantissant son administration par voie intradermique. On pourra utiliser pour cela l’aiguille courte et stérile, bord biseauté vers l’extérieur, d’une seringue graduée contenant de la tuberculine, que l’on introduira dans les couches les plus profondes de la peau. On s’assurera que l’injection a été faite correctement en palpant un petit gonflement de la taille d’un petit pois à chaque point d’injection. On mesurera à nouveau l’épaisseur du pli de la peau de chaque point d’injection 72 heures (+/– 4 h) après l’injection et on notera le résultat.
2.2.5.2. Interprétation des réactions
L’interprétation des résultats se fera sur la base des observations cliniques et de la ou des augmentations enregistrées de l’épaisseur des plis de la peau notées aux points d’injection 72 heures après l’injection de la ou des tuberculines.
a)Réaction négative: on qualifie la réaction de négative si on observe seulement un gonflement limité, avec une augmentation de l’épaisseur du pli de la peau ne dépassant pas 2 mm, sans signes cliniques tels qu’un œdème diffus ou étendu, une exsudation, une nécrose, une douleur ou une inflammation des canaux lymphatiques de cette région ou des ganglions lymphatiques.
b)Réaction douteuse: on qualifie la réaction de douteuse si on n’observe aucun des signes cliniques mentionnés au point a) et si l’augmentation de l’épaisseur du pli de la peau est supérieure à 2 mm et inférieure à 4 mm.
c)Réaction positive: on qualifie la réaction de positive si on observe des signes cliniques mentionnés au point a) ou une augmentation de 4 mm ou plus de l’épaisseur du pli de la peau au point d’injection.
2.2.5.3. L’interprétation des tuberculinations intradermiques officielles sera la suivante:
2.2.5.3.1. Test intradermique simple:
a)positif: réaction positive chez le bovin comme celle décrite au point c) du point 2.2.5.2;
b)douteux: réaction douteuse comme celle décrite au point b) du point 2.2.5.2;
c)négatif: réaction négative chez le bovin comme celle décrite au point a) du point 2.2.5.2. Les animaux chez qui le test intradermique simple a donné des résultats douteux seront soumis à une autre tuberculination après un délai minimal de quarante-deux jours. Les animaux chez qui ce deuxième test ne donne pas de résultats négatifs seront considérés comme positifs. Les animaux chez qui le test intradermique simple donnera des résultats positifs pourront être soumis à un test intradermique comparatif si on soupçonne l’existence d’une réaction positive fausse ou d’une réaction d’interférence.
2.2.5.3.2. Test intradermique comparatif pour la détermination et le maintien du statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose:
a)positif: on assiste à une réaction positive chez le bovin lorsque l’on est en présence de signes cliniques ou que la tuberculine bovine a pour conséquence que l’épaisseur du pli de la peau est supérieure de plus de 4 mm à la réaction à la tuberculine aviaire;
b)douteux: on assiste à une réaction positive ou douteuse chez le bovin lorsqu’il y a absence de signes cliniques et que la tuberculine bovine entraîne une réaction positive ou douteuse dans laquelle l’épaisseur du pli de la peau est de 1 à 4 mm supérieure à la réaction à la tuberculine aviaire;
c)négatif: on assiste à une réaction négative chez le bovin lorsqu’il y a absence de signes cliniques et que la tuberculine bovine entraîne une réaction négative ou une réaction positive ou douteuse avec augmentation de l’épaisseur du pli de la peau égale ou inférieure à une réaction positive ou douteuse à la tuberculine aviaire. Les animaux chez qui les tests intradermiques comparatifs ont donné des résultats douteux devront être soumis à un autre test, après un délai minimal de quarante-deux jours. Les animaux chez qui le deuxième test ne donne pas de résultats négatifs seront considérés comme positifs.
2.2.5.3.3. Le statut de troupeau officiellement indemne de tuberculose pourra être suspendu et les animaux de ce troupeau ne pourront pas faire l’objet d’échanges commerciaux intracommunautaires jusqu’à ce que le statut des animaux suivants soit réglé:
a) les animaux qui ont été considérés comme douteux lors du test intradermique simple;
b)les animaux qui ont été considérés comme positifs lors du test intradermique simple mais qui attendent de subir un nouvel examen sous forme de test intradermique comparatif;
c) les animaux qui ont été considérés comme douteux lors du test intradermique comparatif.
2.2.5.3.4. Lorsque la législation communautaire exige que les animaux soient soumis à un test intradermique avant un déplacement, le test sera interprété de sorte qu’aucun animal montrant une augmentation de l’épaisseur du pli de la peau supérieure à 2 mm ou présentant des signes cliniques ne fasse l’objet d’échanges commerciaux intracommunautaires.
2.2.5.3.5. Afin de permettre la détection du nombre maximal d’animaux infectés ou malades dans un troupeau ou dans une région, les Etats membres pourront modifier les critères d’interprétation du test afin d’en améliorer la sensibilité en considérant toutes les réactions douteuses mentionnées aux points b) des points 2.2.5.3.1. et 2.2.5.3.2. comme des réactions positives.
3. TESTS SUPPLEMENTAIRES
Afin de permettre la détection du nombre maximal d’animaux infectés ou malades dans un troupeau ou dans une région, les Etats membres pourront autoriser, en plus de la tuberculination, l’utilisation du dosage de l’interféron gamma mentionné au chapitre 2.3.3 (tuberculose bovine) de la 4e édition (2000) du manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l’Office international des épizooties (OIE).
4. INSTITUTS D’ETAT ET LABORATOIRES NATIONAUX DE REFERENCE
Tâches et responsabilités
Les instituts d’Etat, laboratoires nationaux de référence ou instituts officiels désignés conformément à l’article 6 bis sont chargés du contrôle officiel des tuberculines ou des réactifs mentionnés aux points 2 et 3 dans leurs Etats membres respectifs afin de garantir leur adéquation avec les normes visées respectivement au point 2.1 et au point 3.
ANNEXE C
BRUCELLOSE
1. IDENTIFICATION DE L’AGENT
La démonstration par coloration acido-résistante modifiée ou immunospécifique de la présence d’organismes ayant la morphologie de Brucella dans des matières abortives, des sécrétions vaginales ou du lait indique la possibilité de brucellose, notamment lorsqu’elle est corroborée par des tests sérologiques. Les techniques d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) constituent un moyen supplémentaire de détection. Les Brucella doivent, si possible, être recherchées par culture, sur des milieux sélectifs ou non, à partir de sécrétions utérines, d’avortons, de sécrétions mammaires ou d’organes comme les noeuds lymphatiques et les organes reproducteurs mâles et femelles.
Une fois les micro-organismes isolés, l’espèce et le biovar doivent être identifiés par lyse de phages et/ou des tests du métabolisme oxydatif selon des critères culturaux, biochimiques et sérologiques. La PCR peut servir à la fois de technique complémentaire et de méthode de typage fondée sur des séquences génomiques spécifiques. Les techniques et les milieux utilisés, leur standardisation et l’interprétation des résultats doivent être conformes aux indications figurant dans le Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE, sixième édition, 2008, chapitre 2.4.3 (brucellose bovine), chapitre 2.7.2 (brucelloses caprine et ovine) et chapitre 2.8.5 (brucellose porcine).
2. TESTS IMMUNOLOGIQUES
2.1. Normes
2.1.1. La souche no 99 de Weybridge ou la souche USDA 1119-3 du biovar 1 de Brucella abortus doit être utilisée pour la préparation de tous les antigènes employés dans le test au rose bengale, l’épreuve de séroagglutination, l’épreuve de fixation du complément et l’épreuve de l’anneau sur le lait.
2.1.2. Le sérum étalon pour les tests susmentionnés est le sérum étalon international de l’OIE (OIEISS) antérieurement dénommé second sérum étalon international anti-Brucella abortus de l’OMS.
2.1.3. Les sérums étalons pour les épreuves d’immuno-absorption enzymatique (tests ELISA) sont les suivants:
– le sérum étalon de référence international de l’OIE (OIEISS),
–le sérum étalon ELISA faiblement positif de l’OIE (OIEELISAWPSS),
– le sérum étalon ELISA fortement positif de l’OIE (OIEELISASPSS),
–le sérum étalon ELISA négatif de l’OIE (OIEELISANSS).
2.1.4. Les sérums étalons pour les tests de polarisation de fluorescence (tests FPA) sont les suivants:
– le sérum étalon ELISA faiblement positif de l’OIE (OIEELISAWPSS),
– le sérum étalon ELISA fortement positif de l’OIE (OIEELISASPSS),
–le sérum étalon ELISA négatif de l’OIE (OIEELISANSS).
2.1.5. Les sérums étalons énumérés aux points 2.1.3 et 2.1.4 sont fournis par le laboratoire communautaire de référence pour la brucellose ou l’Agence des laboratoires vétérinaires [«Veterinary Laboratories Agency (VLA)»], de Weybridge (Royaume-Uni).
2.1.6. Les sérums étalons OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS et OIEELISANSS sont des étalons primaires internationaux à partir desquels des étalons secondaires nationaux («étalons de travail») doivent être établis pour chaque test visé au point 2.1.1 dans chaque Etat membre.
2.2. Epreuves d’immuno-absorption enzymatique (ELISA) ou autres épreuves d’agglutination destinées à la détection de la brucellose bovine dans le sérum ou le lait
2.2.1. Matériel et réactifs
La technique utilisée et l’interprétation des résultats doivent avoir été validées conformément aux principes établis au chapitre 1.1.4 de la sixième édition de 2008 du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE et doivent comprendre au minimum des études de laboratoire et de diagnostic.
2.2.2. Standardisation de l’épreuve
2.2.2.1. Standardisation de la procédure de test pour les échantillons individuels de sérum:
a)une prédilution du sérum OIEISS au 1/150 (1) ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/2 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/16 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) doit produire une réaction positive;
b)une prédilution du sérum OIEISS au 1/600 ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/8 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/64 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) doit produire une réaction négative;
c) le sérum OIEELISANSS doit dans tous les cas produire une réaction négative.
2.2.2.2. Standardisation de la procédure de test pour les échantillons de sérums en mélange:
a)une prédilution du sérum OIEISS au 1/150 ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/2 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/16 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) et à nouveau diluée dans des sérums négatifs avec un facteur de dilution identique au nombre de sérums constituant le mélange doit produire une réaction positive;
b)le sérum OIEELISANSS doit dans tous les cas produire une réaction négative;
c)le test doit être en mesure de détecter la présence d’une infection chez un seul animal du groupe d’animaux dont des échantillons de sérum constituent le mélange.
2.2.2.3. Standardisation de la procédure de test pour les mélanges de lait ou de Lactosérum:
a)une prédilution du sérum OIEISS au 1/1 000 ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/16 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/125 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) et diluée à nouveau au 1/10 dans du lait négatif doit produire une réaction positive;
b)le sérum OIEELISANSS dilué au 1/10 dans du lait négatif doit produire dans tous les cas une réaction négative; Aux fins de la présente annexe, les dilutions indiquées pour la préparation des réactifs liquides sont exprimées par exemple comme 1/150, c’est-à-dire une dilution de 1 pour 150.
c)le test doit être en mesure de détecter la présence d’une infection chez un seul animal du groupe d’animaux dont des échantillons de lait ou de lactosérum constituent le mélange.
2.2.3. Conditions d’utilisation des tests ELISA dans le diagnostic de la brucellose bovine
2.2.3.1. Si l’on utilise les conditions de standardisation mentionnées aux points 2.2.2.1 et 2.2.2.2 pour les tests ELISA sur des échantillons de sérum, la sensibilité diagnostique de l’ELISA doit être égale ou supérieure à celle du test au rose bengale ou de l’épreuve de fixation du complément compte tenu de la situation épidémiologique dans laquelle l’épreuve est utilisée.
2.2.3.2. Si l’on utilise les conditions de standardisation mentionnées au point 2.2.2.3 pour l’ELISA sur des échantillons de lait en mélange, la sensibilité diagnostique de l’ELISA doit être égale ou supérieure à celle de l’épreuve de l’anneau sur le lait compte tenu non seulement de la situation épidémiologique mais également des effectifs moyens ou élevés des élevages considérés.
2.2.3.3. Lorsque les tests ELISA sont utilisés à des fins de certification conformément à l’article 6, paragraphe 1, ou pour l’établissement et le maintien du statut d’un troupeau conformément à l’annexe A, titre II, point 10, le mélange d’échantillons de sérum doit être effectué de manière à ce que les résultats des tests puissent être rapportés de manière indiscutable aux différents animaux inclus dans le mélange. Tout test de confirmation doit être effectué sur des échantillons de sérum individuels.
2.2.3.4. Les tests ELISA peuvent être appliqués à un échantillon de lait prélevé sur le lait collecté dans une exploitation comptant au moins 30% de vaches en période de lactation. Si cette méthode est utilisée, des mesures doivent être prises afin que les échantillons prélevés pour être examinés puissent être rapportés de manière indiscutable aux différents animaux dont provient le lait. Tout test de confirmation doit être effectué sur des échantillons de sérum individuels.
2.3. Test de fixation du complément (TFC)
2.3.1. L’antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline phénolée [NaCl à 0,85% (m/v) et phénol à 0,5% (v/v)] ou dans du tampon véronal. L’antigène peut être livré à l’état concentré pour autant que le facteur de dilution à utiliser soit mentionné sur l’étiquette du flacon. L’antigène doit être stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé.
2.3.2. Les sérums doivent être inactivés de la manière suivante:
–sérum bovin: à une température de 56 à 60 °C pendant 30 à 50 minutes,
–sérum porcin: à une température de 60 °C pendant 30 à 50 minutes.
2.3.3. Afin d’obtenir une réaction satisfaisante, il y a lieu d’utiliser une dose de complément supérieure à la dose minimale nécessaire pour une hémolyse complète.
2.3.4. Les contrôles suivants doivent être effectués lors de chaque série d’épreuves de fixation du complément:
a)contrôle du pouvoir anticomplémentaire du sérum;
b) contrôle de l’antigène;
c)contrôle des hématies sensibilisées;
d)contrôle du complément;
e)contrôle à l’aide d’un sérum positif de la sensibilité au déclenchement de la réaction;
f)contrôle de la spécificité de la réaction à l’aide d’un sérum négatif.
2.3.5. Calcul des résultats
Le sérum étalon OIEISS contient 1 000 unités internationales de FC (UIFC) par ml. Si le sérum étalon est testé dans une méthode donnée, le résultat est exprimé sous la forme d’un titre (c.-à-d. la dilution directe la plus élevée du sérum OIEISS provoquant une hémolyse à 50 %, TOIEISS). Le résultat de l’épreuve pour un sérum exprimé sous la forme de titre (TSERUM) doit être converti en UIFC par ml. De manière à convertir l’expression d’un titre en UIFC, le facteur F nécessaire à la conversion du titre d’un sérum inconnu (TSERUM) éprouvé au moyen de cette méthode est obtenu au moyen de la formule suivante: F = 1 000 × 1/TOIEISS et le contenu en UIFC par ml du sérum (UIFCSERUM) par la formule: UIFCSERUM = F × TSERUM.
2.3.6. Interprétation des résultats
Un sérum contenant 20 UIFC par ml ou plus est considéré comme positif.
2.4. Epreuve de l’anneau sur le lait
2.4.1. L’antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline phénolée [NaCl à 0,85% (m/v) et phénol à 0,5% (v/v)] colorée à l’hématoxyline. L’antigène doit être stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé.
2.4.2. La sensibilité de l’antigène doit être étalonnée par rapport au sérum étalon OIEISS de manière à obtenir une réaction positive avec une dilution au 1/500 de ce sérum étalon dans du lait négatif et une réaction négative à une dilution au 1/1 000 de ce même sérum.
2.4.3. L’épreuve de l’anneau doit être effectuée sur des échantillons représentatifs du contenu de chaque bidon de lait ou du contenu de chaque cuve de l’exploitation.
2.4.4. Les échantillons de lait ne doivent pas avoir été congelés, chauffés ni violemment agités.
2.4.5. La réaction doit être réalisée en utilisant l’une des méthodes suivantes:
–sur une colonne de lait d’au moins 25 mm de hauteur et un volume de lait de 1 ml additionné de 0,03 ou 0,05 ml d’un antigène coloré et titré,
–sur une colonne de lait d’au moins 25 mm de hauteur et un volume de lait de 2 ml additionné de 0,05 ml d’un antigène coloré et titré,
– sur un volume de lait de 8 ml additionné de 0,08 ml d’un antigène coloré et titré.
2.4.6. Le mélange de lait et d’antigène doit être incubé à 37 °C pendant 60 minutes et l’épreuve doit être effectuée parallèlement sur des laits de contrôle positif et négatif. La sensibilité de l’épreuve est améliorée si l’incubation est prolongée à 4 °C durant une période de 16 à 24 heures.
2.4.7. Interprétation des résultats:
a)réaction négative: lait coloré, crème non colorée;
b)réaction positive:– lait et crème colorés de façon identique, ou
–lait non coloré et crème colorée.
2.5. Epreuve à l’antigène brucellique tamponné (test au rose bengale)
2.5.1. L’antigène consiste en une suspension bactérienne dans un diluant d’antigène de Brucella tamponné à pH 3,65 ± 0,05 colorée au rose bengale. L’antigène doit être livré prêt à l’emploi, stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé.
2.5.2. L’antigène est préparé sans référence à la concentration cellulaire, mais sa sensibilité doit être étalonnée par rapport au sérum étalon OIEISS de manière à obtenir une réaction positive pour une dilution du sérum au 1/45 et une réaction négative pour une dilution au 1/55.
2.5.3. Le test au rose bengale est réalisé de la manière suivante:
a) le sérum (20-30 μl) est mélangé avec un volume égal d’antigène sur un carreau blanc ou une plaque émaillée pour produire une zone d’un diamètre de 2 cm environ. Le mélange est agité délicatement pendant quatre minutes à la température ambiante puis est observé sous un bon éclairage pour visualiser toute agglutination;
b) une méthode automatisée peut être utilisée pour autant qu’elle soit au moins aussi sensible et exacte que la méthode manuelle.
2.5.4. Interprétation des résultats
Toute réaction visible est considérée comme positive à moins que le séchage ne soit excessif sur les bords.
Des sérums de contrôle positifs et négatifs doivent être inclus dans chaque série d’épreuves.
2.6. Epreuve de séro-agglutination
2.6.1. L’antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline au phénol [NaCl à 0,85% (m/v) et phénol à 0,5 % (v/v)]. Le formaldéhyde ne doit pas être utilisé. L’antigène peut être livré à l’état concentré pour autant que le facteur de dilution à utiliser soit mentionné sur l’étiquette du flacon. De l’EDTA peut être ajouté à la suspension d’antigène jusqu’à l’obtention d’une dilution finale d’épreuve de 5 mM afin de réduire le taux de réactions faussement positives dans l’épreuve de séro-agglutination. Le pH doit ultérieurement être réajusté à 7,2 dans la suspension d’antigène.
2.6.2. Le sérum étalon OIEISS contient 1 000 unités internationales d’agglutination.
2.6.3. L’antigène est préparé sans référence à la concentration cellulaire mais sa sensibilité doit être étalonnée par rapport au sérum étalon OIEISS de manière à obtenir une agglutination de 50% pour une dilution finale du sérum entre le 1/600 et le 1/1000 ou une agglutination de 75% pour une dilution finale du sérum entre le 1/500 et le 1/750. Il peut également être utile de comparer la réactivité des nouveaux lots d’antigène et des lots d’antigène étalonnés antérieurement en utilisant un groupe de sérums définis.
2.6.4. Le test est effectué dans des tubes ou sur des microplaques. Le mélange d’antigène et de dilutions de sérum doit être incubé pendant une durée de 16 à 24 heures à une température de 37 °C. Trois dilutions au moins doivent être préparées pour chaque sérum. Les dilutions de sérum suspect doivent être effectuées de manière à ce que la lecture de la réaction à la limite de la positivité soit réalisée dans le tube intermédiaire (ou le puits intermédiaire pour la méthode des microplaques).
2.6.5. Interprétation des résultats
Le degré d’agglutination de Brucella dans un sérum doit être exprimé en UI par ml.
Un sérum contenant 30 UI par ml ou plus est considéré comme positif.
2.7. Test de polarisation de fluorescence
2.7.1. Le test de polarisation de fluorescence peut être effectué dans des tubes de verre ou sur des microplaques 96 puits. La technique utilisée, sa standardisation et l’interprétation des résultats doivent être conformes aux indications figurant au chapitre 2.4.3 (brucellose bovine) du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE, sixième édition, 2008.
2.7.2. Standardisation de l’épreuve
Le test de polarisation de fluorescence est standardisé de manière à ce que:
a)les sérums OIEELISASPSS et OIEELISAWPSS donnent systématiquement un résultat positif;
b)une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/8 ou une prédilution du sérum OIEELISASPSS au 1/64 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) produise dans tous les cas une réaction négative;
c)le sérum OIEELISANSS produise dans tous les cas une réaction négative.
Doivent être inclus dans chaque lot de tests: des étalons de travail fortement positif, faiblement positif et négatif (étalonnés par rapport aux sérums étalons ELISA de l’OIE).
3. TESTS COMPLEMENTAIRES
3.1. Test cutané de la brucellose
3.1.1. Conditions d’utilisation du test
a)Le test cutané de la brucellose ne peut pas être utilisé à des fins de certification dans les échanges intracommunautaires.
b)Le test cutané de la brucellose est l’une des épreuves les plus spécifiques pour la détection de la brucellose chez les animaux non vaccinés; le diagnostic ne doit toutefois pas reposer uniquement sur des réactions intradermiques positives.
c)Les animaux de l’espèce bovine ayant produit un résultat négatif à l’un des tests sérologiques définis à la présente annexe et une réaction positive au test cutané de la brucellose sont considérés comme infectés ou soupçonnés être infectés.
d)Les animaux de l’espèce bovine ayant donné un résultat positif à l’un des tests sérologiques définis à la présente annexe peuvent être soumis à un test cutané de la brucellose afin de confirmer l’interprétation des résultats des tests sérologiques, notamment quand une réaction croisée avec des anticorps dirigés contre d’autres bactéries ne peut être exclue dans le cas des troupeaux bovins officiellement indemnes de brucellose ou indemnes de brucellose.
3.1.2. L’épreuve doit être effectuée en utilisant une préparation allergénique standardisée et définie ne contenant pas d’antigène lipopolyosidique (LPS) lisse, celui-ci pouvant provoquer des réactions inflammatoires non spécifiques ou interférer avec des tests sérologiques ultérieurs. Les conditions applicables à la production de brucelline sont décrites en détail à la section C1 du chapitre 2.4.3 du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE, sixième édition, 2008.
3.1.3. Procédure du test
3.1.3.1. Un volume de 0,1 ml d’allergène de la brucellose est injecté par voie intradermique au pli caudal, au flanc ou sur le côté de l’encolure.
3.1.3.2. Le test est lu au bout de 48 à 72 heures.
3.1.3.3. Avant l’injection et lors du réexamen, l’épaisseur de la peau au site d’injection est mesurée avec un cutimètre.
3.1.3.4. Interprétation des résultats
Les réactions fortes sont facilement identifiables en raison d’une inflammation et d’une induration locales.
Un épaississement de la peau de 1,5 à 2 mm est considéré comme réaction positive au test cutané de la brucellose.
3.2. Test d’immuno-absorption enzymatique de compétition (cELISA)
3.2.1. Conditions d’utilisation du test cELISA
Le test cELISA ne peut pas être utilisé à des fins de certification dans les échanges intracommunautaires.
Les animaux de l’espèce bovine ayant donné un résultat positif à l’un des autres tests sérologiques définis à la présente annexe peuvent être soumis à un test cELISA afin de confirmer l’interprétation des résultats des autres tests sérologiques, notamment quand une réaction croisée avec des anticorps dirigés contre d’autres bactéries ne peut être exclue dans le cas des troupeaux bovins officiellement indemnes de brucellose ou indemnes de brucellose ou afin d’éliminer les réactions dues aux anticorps résiduels liés à la vaccination par le B19.
3.2.2. Procédure du test
Le test sera réalisé selon les prescriptions figurant à la section B2 du chapitre 2.4.3 du Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE, sixième édition, 2008.
4. LABORATOIRES NATIONAUX DE REFERENCE
Tâches et responsabilités
Les tâches des laboratoires nationaux de référence désignés conformément à l’article 6 bis sont les suivantes:
a)approbation des résultats des études de validation démontrant la fiabilité de la méthode de test utilisée dans l’Etat membre;
b) détermination du nombre maximal d’échantillons pouvant constituer un mélange dans les kits ELISA utilisés;
c)étalonnage des sérums étalons nationaux secondaires («étalons de travail») par rapport au sérum étalon primaire international visé au paragraphe 2.1;
d)contrôles de la qualité de tous les lots de kits ELISA et d’antigènes utilisés dans l’Etat membre;
e)coopération au sein du réseau des laboratoires nationaux de référence pour la brucellose.
ANNEXE D
CHAPITRE I
TROUPEAUX, ETATS MEMBRES ET REGIONS OFFICIELLEMENT INDEMNES DE LEUCOSE BOVINE ENZOOTIQUE
A.Un troupeau est officiellement indemne de leucose bovine enzootique si:i)aucun cas de leucose bovine enzootique n’a été décelé dans le troupeau ni confirmé au cours des deux dernières années, que ce soit cliniquement ou à la suite d’un test pratiqué en laboratoire et
ii) tous les animaux de plus de vingt-quatre mois ont présenté une réaction négative au cours des douze derniers mois à deux tests pratiqués conformément à la présente annexe, à un intervalle de quatre mois au moins ou
iii)il remplit les exigences prévues au point i) et est situé dans un Etat membre ou une région officiellement indemne de leucose bovine enzootique.
B.Un troupeau conserve son statut de troupeau officiellement indemne de leucose bovine enzootique si:i) la condition prévue à la section A, point i), continue d’être remplie;
ii)tous les animaux introduits dans le troupeau proviennent d’un troupeau officiellement indemne de leucose bovine enzootique;
iii)tous les animaux de plus de vingt-quatre mois continuent de présenter une réaction négative à un test pratiqué conformément au chapitre II à des intervalles de trois ans;
iv)les animaux d’élevage introduits dans un troupeau et provenant d’un pays tiers ont été importés conformément à la directive 72/462/CEE.
C.Le statut de troupeau officiellement indemne de leucose est suspendu si les conditions énumérées à la section B ne sont pas remplies, ou si, sur la base de tests effectués en laboratoire ou pour des raisons cliniques, un ou plusieurs bovins sont suspectés d’être atteints de leucose bovine enzootique et si l’animal (les animaux) suspect(s) a (ont) été immédiatement abattu(s).
D.Le statut reste suspendu jusqu’à ce que les exigences suivantes soient remplies:1.Si, dans un troupeau officiellement indemne de leucose bovine enzootique, un animal isolé a présenté une réaction positive à l’un des tests visés au chapitre II ou lorsqu’un animal d’un troupeau est suspecté d’être atteint de l’infection:i) l’animal, ayant présenté une réaction positive et, s’il s’agit d’une vache, le cas échéant, ses veaux doivent quitter le troupeau pour être abattus sous contrôle des autorités vétérinaires;
ii)tous les animaux du troupeau âgés de plus de douze mois ont été soumis avec un résultat négatif à deux tests sérologiques (à un intervalle de quatre mois au moins et de douze mois au plus) effectués conformément au chapitre II trois mois au moins après élimination de l’animal ayant présenté une réaction positive et de sa progéniture éventuelle;
iii)une enquête épidémiologique a été menée et a donné des résultats négatifs et les troupeaux présentant un lien épidémiologique avec le troupeau infecté ont été soumis aux mesures prévues au point ii). Toutefois, l’autorité compétente peut accorder une dérogation à l’obligation d’abattage du veau d’une vache infectée lorsque ce veau a été séparé de sa mère immédiatement après vêlage. Dans ce cas, le veau doit être soumis aux exigences prévues au point 2 iii).
2.Lorsque plus d’un animal provenant d’un troupeau officiellement indemne de leucose bovine enzootique a présenté une réaction positive à l’un des tests visés au chapitre II ou lorsque l’on suspecte que plus d’un animal d’un troupeau est atteint de l’infection:i)tout animal ayant présenté une réaction positive et, s’il s’agit d’une vache, ses veaux doivent quitter le troupeau pour être abattus sous contrôle des autorités vétérinaires;
ii)tous les animaux du troupeau âgés de plus de douze mois doivent présenter une réaction négative à deux tests pratiqués conformément au chapitre II à un intervalle de quatre mois au moins et de douze mois au plus;
iii)tous les autres animaux du troupeau doivent, après identification, rester sur l’exploitation jusqu’à ce qu’ils aient dépassé l’âge de vingt-quatre mois et aient été soumis aux tests prévus au chapitre II après avoir atteint cet âge, l’autorité compétente pouvant toutefois permettre que ces animaux soient directement acheminés à l’abattage sous surveillance officielle;
iv) une enquête épidémiologique a été menée et a conduit à des résultats négatifs et les troupeaux présentant un lien épidémiologique avec le troupeau infecté ont été soumis aux mesures prévues au point ii). Toutefois, l’autorité compétente peut accorder une dérogation à l’obligation d’abattage du veau d’une vache infectée lorsque ce veau a été séparé de sa mère immédiatement après vêlage. Dans ce cas, le veau doit être soumis aux exigences prévues au point 2 iii).
E.Conformément à la procédure du Comité vétérinaire permanent et sur la base des informations fournies conformément à l’article 8, un Etat membre ou une partie d’un Etat membre peut être considéré(e) comme officiellement indemne de leucose bovine enzootique si: a)toutes les conditions prévues au point A sont remplies et si au moins 99,8% des troupeaux bovins sont des troupeaux officiellement indemnes de leucose bovine enzootique ou
b) aucun cas de leucose bovine enzootique n’a été confirmé dans l’Etat membre ou dans la partie de l’Etat membre au cours des trois dernières années, et la présence de tumeurs dont on soupçonne qu’elles sont dues à une leucose bovine enzootique doit obligatoirement faire l’objet d’une notification et doit donner lieu à une enquête, et s’il s’agit d’un Etat membre, les contrôles aléatoires pratiqués conformément au chapitre II pendant une période de deux ans sur tous les animaux âgés de plus de vingt-quatre mois dans au moins 10% des troupeaux ont donné des résultats négatifs ou s’il s’agit d’une partie d’un Etat membre, tous les animaux âgés de plus de vingt-quatre mois ont été soumis à un test prévu au chapitre II avec des résultats négatifs conformément au chapitre II pendant une période de deux ans ou
c)il est démontré au moyen de toute autre méthode, avec un taux de certitude de 99%, que moins de 0,2% des troupeaux ont été infectés.
F.Un Etat membre ou une partie d’un Etat membre conserve son statut d’officiellement indemne de leucose bovine enzootique si:a)tous les animaux abattus sur le territoire de cet Etat membre ou de cette partie sont soumis à une inspection post mortem officielle lors de laquelle toutes les tumeurs qui pourraient être dues au virus de la leucose bovine enzootique font l’objet d’un examen de laboratoire;
b)l’Etat membre informe la Commission de l’apparition de tous les cas de leucose bovine enzootique dans la région;
c)tous les animaux présentant une réaction positive à un des tests prévus au chapitre II sont abattus et le troupeau reste sous restriction jusqu’au rétablissement de son statut conformément à la section D;
d)tous les bovins âgés de plus de deux ans ont été testés, soit une fois au cours des cinq premières années après l’obtention du statut conformément au chapitre II, soit au cours des cinq premières années après l’obtention du statut par toute autre méthode démontrant avec un taux de certitude de 99% que moins de 0,2% des troupeaux ont été infectés. Toutefois, lorsqu’aucun cas de leucose bovine enzootique n’a été enregistré dans l’Etat membre ou dans la partie d’un Etat membre dans une proportion d’un troupeau sur 10 000 pendant au moins trois ans, une décision peut être prise selon la procédure de l’article 17 visant à réduire les contrôles sérologiques de routine, pour autant que tous les bovins âgés de plus de douze mois dans au moins 1% des troupeaux, choisis au hasard chaque année, aient été soumis à un test effectué conformément au chapitre II.
G.Un Etat membre ou une partie d’un Etat membre reconnu(e) officiellement indemne de leucose bovine enzootique voit ce statut suspendu, conformément à la procédure du Comité vétérinaire permanent, s’il est avéré, à l’issue d’enquêtes menées conformément au point F, qu’un changement important est intervenu dans sa situation concernant la leucose bovine enzootique.Ledit statut peut être rétabli conformément à la procédure du Comité vétérinaire permanent si les critères fixés par cette même procédure sont remplis.
CHAPITRE II
EPREUVES POUR LA RECHERCHE DE LA LEUCOSE BOVINE ENZOOTIQUE
La recherche de la leucose bovine enzootique est effectuée au moyen de l’épreuve de l’immunodiffusion dans les conditions décrites aux sections A et B ci-après ou par l’épreuve d’immuno-absorption enzymatique (Elisa) dans les conditions décrites à la section C ci-après. La méthode d’immunodiffusion est réservée aux tests individuels. Si les résultats des tests font l’objet d’une contestation motivée, un contrôle complémentaire est pratiqué au moyen d’une épreuve d’immunodiffusion.
A.
Epreuve d’immunodiffusion sur plaque de gélose pour la recherche de la leucose bovine enzootique
1.L’antigène à utiliser dans cette épreuve doit contenir des glycoprotéines du virus de la leucose bovine. L’antigène doit être standardisé par rapport à un sérum étalon (sérum El) fourni par le National Veterinary Institute, Technical University of Denmark, Copenhagen V.
2.Les instituts d’Etat, laboratoires nationaux de référence ou instituts officiels désignés conformément à l’article 6 bis pour la coordination des normes et des méthodes de diagnostic pour la recherche de la leucose bovine enzootique doivent être chargés d’étalonner l’antigène standard de travail du laboratoire par rapport au sérum étalon officiel CE (sérum EI) fourni par l’Institut vétérinaire national, Université technique du Danemark.
3.Les antigènes étalons utilisés au laboratoire doivent être soumis au moins une fois par an aux instituts d’Etat, laboratoires nationaux de référence ou instituts officiels désignés conformément à l’article 6 bis pour y être testés par rapport au sérum étalon CE officiel. Indépendamment de cette standardisation, l’antigène utilisé peut être étalonné conformément à la méthode décrite à la section B.
4.L’épreuve met en œuvre les réactifs suivants:a)antigène: l’antigène doit contenir des glycoprotéines spécifiques du virus de leucose bovine enzootique qui a été standardisé par rapport au sérum officiel CEE;
b)le sérum à tester;
c)un sérum de contrôle positif connu;
d) gélose;0,8% agar,
8,5% NaCl,
tampon Tris 0,05 M, pH 7,2,
15 millilitres de cette gélose doivent être coulés dans une boîte de Petri de 85 millimètres de diamètre, ce qui donne une profondeur de 2,6 millimètres de gélose.
5.Un dispositif expérimental de sept loges exemptes d’humidité doit être réalisé par perforation de la gélose jusqu’au fond de la plage; ce réseau consiste en une loge centrale autour de laquelle s’ordonnent six loges périphériques disposées en cercle.Diamètre de la loge centrale: 4 millimètres
Diamètre des loges périphériques: 6 millimètres
Distance entre les loges centrales et périphériques: 3 millimètres.
6.La loge centrale doit être remplie de l’antigène étalon. Les loges périphériques 1 et 4 (schéma ci-dessous) sont remplies avec le sérum positif connu, les loges 2, 3, 5 et 6 avec les sérums à tester. Les loges doivent être remplies jusqu’à disparition du ménisque
7.Les quantités obtenues sont les suivantes:antigène: 32 microlitres,
sérum de contrôle: 73 microlitres,
sérum à tester: 73 microlitres.
8.L’incubation doit durer soixante-douze heures à température ambiante (20 - 27°C) dans une enceinte humide fermée.
9.L’épreuve peut être lue après vingt-quatre heures, puis après quarante-huit heures, mais aucun résultat final ne peut être obtenu avant soixante-douze heuresa)un sérum à tester est positif s’il forme une courbe de précipitation spécifique avec l’antigène du virus de la leucose bovine et si cette courbe coïncide avec celle du sérum de contrôle;
b)un sérum à tester est négatif s’il ne donne pas une courbe de précipitation spécifique avec l’antigène du virus de la leucose bovine et s’il n’infléchit pas la courbe du sérum de contrôle;
c) la réaction ne pourrait être considérée comme concluante si:i)elle infléchit la courbe du sérum de contrôle vers la loge de l’antigène du virus de la leucose bovine sans former une courbe de précipitation visable avec l’antigène ou
ii)s’il n’est pas possible de l’interpréter comme négative ou positive.Pour les réactions non concluantes, on peut répéter l’épreuve et utiliser du sérum concentré.
10.Toute autre configuration ou tout autre dispositif de loges peut être utilisé pour autant que le sérum E4 dilué au 1/10 dans du sérum négatif puisse être identifié comme positif.
B.
Méthode de standardisation de l’antigène
Solutions et matériels nécessaires
1.40 millilitres de gélose à 1,6% dans un tampon Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2 avec 8,5% de NaCl;
2.15 millilitres d’un sérum de leucose bovine n’ayant d’anticorps qu’à l’égard des glycoprotéines du virus de la leucose bovine, sérum dilué au 1/10 dans un tampon Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2 avec 8,5% de NaCl;
3.15 millilitres d’un sérum de la leucose bovine n’ayant d’anticorps qu’à l’égard des glycoprotéines du virus de la leucose bovine, sérum dilué au 1/15 dans un tampon Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2 avec 8,5% NaCl;
4.quatre boîtes de Petri en matière plastique, d’un diamètre de 85 millimètres;
5. un poinçon d’un diamètre de 4 à 6 millimètres;
6. un antigène de référence;
7.l’antigène à standardiser;
8. un bain d’eau chaude (56 °C).
Mode opératoire
Dissoudre la gélose (1,6%) dans le tampon Tris/HCl en chauffant avec précaution jusqu’à 100 °C. Mettre en place le bain d’eau à 56 °C pour environ une heure. Placer en outre les solutions du sérum de la leucose bovine dans le bain d’eau à 56 °C.
Mélanger ensuite 15 millilitres de la solution de gélose à 56 °C avec les 15 millilitres de sérum de la leucose bovine (1:10), agiter rapidement et verser dans deux boîtes de Petri, à raison de 15 millilitres par boîte. Recommencer les opérations précédemment décrites avec le sérum de la leucose bovine dilué au 1/5.
Lorsque la gélose a durci, les trous y sont pratiqués de la manière suivante:
Addition d’antigènes
i)Boîtes de Petri n° 1 et 3: loge A = antigène de référence non dilué,
loge B = antigène de référence dilué à 1/2,
loge C + E = antigènes de référence,
loge D = antigène à tester, non dilué.
ii)Boîtes de Petri n° 2 et 4:loge A = antigène à tester, non dilué,
loge B = antigène à tester, dilué à 1/2,
loge C = antigène à tester, dilué à 1/4,
loge D = antigène à tester, dilué à 1/8.
Instructions complémentaires
1.L’expérience doit être effectuée avec deux degrés de dilution du sérum (1:5 et 1:10) afin d’obtenir la précipitation optimale.
2. Si le diamètre de précipitation est trop faible pour chacun des deux degrés de dilution, le sérum doit faire l’objet d’une dilution supplémentaire.
3.Si le diamètre de précipitation est excessif pour les deux degrés de dilution et si le précipité disparaît, un degré de dilution plus faible doit être choisi pour le sérum.
4.La concentration finale de la gélose doit s’établir à 0,8% et celle des sérums à 5% et à 10% respectivement.
5. Noter les diamètres mesurés dans le système coordonné suivant. La dilution de travail est celle où on enregistre le même diamètre pour l’antigène à tester que pour l’antigène de référence.
C.
Epreuves d’immuno-absorption enzymatique (Elisa) pour la recherche de la leucose bovine enzootique
1. Les matériels et réactifs à utiliser sont les suivants:a)des microplaques pour phase solide, des cuvettes ou toute autre phase solide;
b)l’antigène est fixé sur la phase solide avec ou sans l’aide d’anticorps de captage polyclonaux ou monoclonaux. Dans le cas de la LBE, si l’antigène est associé directement à la phase solide, tous les échantillons soumis à l’examen présentant une réaction positive doivent être examinés par rapport à l’antigène de contrôle. Celui-ci devrait être identique à l’antigène examiné, sauf en ce qui concerne les antigènes BLV. Si les anticorps de captage sont associés à la phase solide, les anticorps ne doivent pas réagir à des antigènes autres que les antigènes BLV;
c) le liquide biologique à examiner;
d) des contrôles positifs et négatifs correspondants;
e)le conjugué;
f)un substrat adapté à l’enzyme utilisé;
g)une solution d’obturation, si nécessaire;
h) des solutions pour la dilution des échantillons examinés, la préparation des réactifs et le lavage;
i)un système de lecture approprié au substrat utilisé.
2.
Standardisation et sensibilité du test
La sensibilité du test Elisa doit être d’un niveau tel que le sérum E4 présente une réaction positive lorsqu’il est dilué 10 fois (échantillons de sérum) ou 250 fois (échantillons de lait) plus que la dilution obtenue à partir d’échantillons mis en commun. Lors d’essais où les échantillons (sérums et lait) sont examinés individuellement, le sérum E4 dilué à raison de 1 pour 10 (sérum négatif) ou de 1 pour 250 (lait négatif) doit présenter une réaction positive lorsqu’il est examiné dans la même dilution d’essai que celle utilisée pour les essais individuels. Les instituts officiels indiqués au point A.2 seront responsables du contrôle de qualité de la méthode Elisa, notamment pour déterminer, pour chaque lot de production, le nombre d’échantillons à mettre en commun en fonction du titre obtenu pour le sérum E4.
Le sérum E4 sera fourni par le laboratoire vétérinaire national de Copenhague.
3.
Conditions d’utilisation du test Elisa pour la recherche de la LBE
La méthode Elisa peut être utilisée sur un échantillon de lait ou de lactosérum de lait provenant d’une exploitation comprenant au moins 30% de vaches laitières en lactation.
En cas de recours à la faculté précitée, des mesures doivent être prises pour assurer une correspondance entre les échantillons prélevés et les animaux dont proviennent le lait ou les sérums examinés.
ANNEXE E (I)
a)
Maladies des bovins
– Fièvre aphteuse
–Rage
–Tuberculose
–Brucellose
–Pleuropneumonie contagieuse bovine
–Leucose bovine enzootique
–Charbon bactéridien.
b)
Maladies des porcs
–Rage
–Brucellose
–Peste porcine classique
– Peste porcine africaine
– Fièvre aphteuse
– Maladie vésiculeuse du porc
–Charbon bactéridien.
ANNEXE E (II)
–Maladie d’Aujeszky
–Rhinotrachéite infectieuse bovine
–Infection due à Brucella suis
–Gastro-entérite transmissible.
ANNEXE F
Modèle 1
Certificat sanitaire pour les animaux des espèces
bovines de boucherie(1) / d’élevage(1)/ de rente(1)
Etat membre d’origine: Grand-Duché de Luxembourg
Numéro du certificat (7)
SECTION A
Nom et adresse de l’expéditeur:......................................................................................................
.........................................................................................................................................................
Nom et adresse de l’exploitation d’origine:......................................................................................
.......................................................................................................................................................(2)
Numéro d’agrément du négociant:..................................................................................................
.......................................................................................................................................................(3)
Adresse et numéro d’agrément du centre de rassemblement dans l’Etat membre
d’origine(1) ou de transit(1) :
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................(3)
.......................................................................................................................................................(3)
Informations sanitaires:
Je certifie que chaque animal du lot décrit ci-après:
1.provient d’une exploitation d’origine et d’une zone qui, conformément à la législation communautaire ou nationale, ne font l’objet d’aucune interdiction ou limitation liée à des maladies animales touchant les espèces bovines;
2.provient d’un troupeau d’origine situé dans un Etat membre ou une partie de son territoire:a)ayant mis en place un réseau de surveillance approuvé par la décision ../../CE de la Commission(3),
b) qui est reconnu:
- officiellement indemne de tuberculose:
Décision ../..../CE de la Commission(3)
- officiellement indemne de brucellose:
Décision ../..../CE de la Commission(3)
- officiellement indemne de leucose:
Décision ../..../CE de la Commission(3)
3.(3)
est un animal d’élevage(1) ou de rente(1) qui:
-
a séjourné, selon les informations disponibles, dans l’exploitation d’origine au cours des trente derniers jours ou depuis sa naissance s’il est âgé de moins de trente jours et qu’aucun animal importé d’un pays tiers n’a été introduit dans cette exploitation au cours de cette période, à moins qu’il n’ait été complètement isolé des autres animaux de l’exploitation;
-
provient d’un troupeau officiellement indemne de tuberculose, de brucellose et de leucose et a été testé avec résultat négatif dans les trente jours précédant le départ de l’exploitation d’origine, conformément à l’article 6, paragraphe 2, de la directive 64/432/CEE, comme suit:
Test
Test non exigé pour les
catégories d’animaux
ci-après
Exigé
Oui/Non
(4)
(5)
Date du test ou
de l’échantillonnage
Test tuberculinique
Animaux de moins de
6 semaines
Séro-agglutination brucellique(6)
Animaux castrés et
animaux de moins de
12 mois
Test leucosique
Animaux de moins de
12 mois
4.(3)
est un animal de boucherie provenant d’un troupeau officiellement indemne de tuberculose et de leucose et est:
-
soit castré(3)
-
soit non castré et provient d’un troupeau officiellement indemne de brucellose(3)
5.(3)
est un animal de boucherie originaire d’un troupeau non officiellement indemne de tuberculose, de brucellose et de leucose et est expédié conformément à l’article 6, paragraphe 3, de la directive 64/432/CEE sous la licence no ……………….. en provenance d’une exploitation située en Espagne et a été testé avec résultat négatif dans les trente jours précédant le départ de l’exploitation d’origine, comme suit:
Test
Date du test ou
de l’échantillonnage
Test tuberculinique
Séro-agglutination brucellique(6)
Test leucosique
6.(11)
remplit, compte tenu des informations fournies soit dans un document officiel, soit dans un certificat dans lequel les sections A et B ont été remplies par le vétérinaire officiel ou par le vétérinaire agréé responsable de l’exploitation d’origine, les exigences applicables en matière de santé des points 1 à 5 de la section A qui ne sont, par conséquent, pas énumérés dans ce certificat
7.(3)
est un animal âgé de moins de trente mois destiné à la production de viande originaire d’un troupeau officiellement indemne de tuberculose, de brucellose et de leucose, et est expédié conformément à l’article 6, paragraphe 2, point e), de la directive 64/432/CEE sous la licence
no …………………………………
SECTION B
Description du lot
Date de départ:......................................................…........
Nombre total d’animaux:..................................……...........
Identification de l’animal (des animaux):
Numéro du passeport
Numéro du passeport
Numéro du document temporaire
(pour les animaux âgés de
moins de quatre semaines)
Utiliser, si nécessaire, une liste supplémentaire qui sera jointe,
revêtue de la signature et du cachet du vétérinaire officiel ou agréé
Numéro d’agrément du transporteur (s’il est différent du transporteur figurant à la section C et/ou si la distance de transport est supérieure à 50 km):.........
Moyen de transport:........………….....Numéro d’enregistrement:.....……………….....
Certification au titre des sections A et B
Cachet officiel
Lieu
Date
Signature(*)
Nom et qualité en lettres majuscules:
Adresse du vétérinaire qui signe le document:
(*) Les sections A et B doivent être revêtues du cachet et de la signature du vétérinaire officiel
de l’exploitation d’origine si ce n’est pas le même que celui qui signe la section C
ou
être signées par le vétérinaire agréé de l’exploitation d’origine lorsque l’Etat membre
d’expédition a mis en place un système de réseaux de surveillance approuvé au titre de la
décision ../.../CE de la Commission
ou
être signées par le vétérinaire officiel responsable du centre de rassemblement agréé à la date
de départ des animaux.
SECTION C(9)
Nom et adresse du destinataire:
......................................................................................……………………………………
......................................................................................……………………………………
Nom et adresse de l’exploitation de destination(1) ou du centre de rassemblement agréé dans l’Etat membre de destination(1) (compléter cette rubrique en lettres d’imprimerie):
Nom: ................................................………..........................
Rue: ............................................................………...............
Code postale:............ Etat membre:.........................................
Numéro d’agrément du négociant:.............................................. (3)
Numéro d’agrément du transporteur (si la distance de transport est supérieure à 50 km)(10)
Moyens de transport: ....................... Numéro d’enregistrement: ...........
Après inspection réglementaire, je certifie que:
1.
les animaux décrits ci-dessus ont été inspectés le .............(date) dans les 24 heures précédant le départ prévu et n’ont présenté aucun signe clinique de maladie infectieuse ou contagieuse;
2.
l’exploitation d’origine et, le cas échéant, le centre de rassemblement agréé et la zone dans laquelle ils sont situés ne font l’objet d’aucune interdiction ou limitation liée à des maladies animales touchant les espèces bovines conformément à la législation communautaire ou nationale;
3.
toutes les dispositions applicables de la directive 64/432/CEE du Conseil sont respectées;
4.(3)
les animaux ci-dessus sont conformes aux garanties additionnelles pour:
-
Maladie: ...................................................................
-
Conformément à la décision ../…./CE de la Commission;
5.
les animaux ne sont pas restés plus de six jours dans le centre de rassemblement agréé(3) ;
6.
au moment de l’inspection, les animaux indiqués ci-dessus étaient aptes à être transportés sur le trajet prévu, conformément aux dispositions du règlement (CE) no 1/2005 (12) ;
Certification au titre de la section C
Cachet officiel
Lieu
Date
Signature(*)
Nom et qualité en lettres majuscules:
Adresse du vétérinaire qui signe le certificat:
(*) La section C du certificat doit être revêtue du cachet et de la signature du vétérinaire officiel de l’exploitation d’origine
ou
du centre de rassemblement agréé situé dans l’Etat membre d’origine
ou
du centre de rassemblement agréé situé dans l’Etat membre de transit lorsqu’il remplit le certificat d’expédition des animaux vers l’Etat membre de destination.
Informations supplémentaires:
1.Ce certificat doit être revêtu d’un cachet et d’une signature d’une couleur différente de celle utilisée pour l’impression.
2.Ce certificat est valable pendant dix jours à compter de la date de l’inspection sanitaire effectuée dans l’Etat membre d’origine et visée à la section C.
3.Les renseignements devant figurer sur ce certificat doivent être introduits dans le système ANIMO à la date d’émission du certificat et au plus tard dans les 24 heures suivant celle-ci.
----------------------
(1)
Biffer les mentions inutiles.
(2)
Ne s’applique pas lorsque les animaux sont originaires de plusieurs exploitations.
(3)
Biffer la mention inutile.
(4)
Non exigé si un système de réseaux de surveillance est approuvé par la décision ../../CE de la Commission.
(5)
Non exigé si l’Etat membre ou la partie du territoire de l’Etat membre où est situé le troupeau est reconnu comme officiellement indemne de la maladie concernée.
(6)
Ou tout autre test agréé conformément à l’article 17 de la directive 64/432/CEE.
(7)
A compléter par le vétérinaire officiel de l’Etat membre d’origine.
(8)
A compléter par le vétérinaire officiel du centre de rassemblement agréé de l’Etat membre de transit.
(9)
Biffer si le certificat est utilisé pour le mouvement d’animaux dans l’Etat membre d’origine et que seules les sections A et B sont complétées et signées.
(10)
Biffer si le transporteur n’est pas différent de celui identifié à la section B.
(11)
Le point 6 de la section A doit être signé par le vétérinaire officiel au centre de rassemblement agréé après un contrôle des documents et de l’identité des animaux qui arrivent avec un document officiel ou un certificat complété des sections A et B, dans le cas contraire ce point doit être biffé.
(12)
Cette déclaration ne dispense pas les transporteurs des obligations qui leur incombent en vertu des dispositions communautaires en vigueur, notamment pour ce qui est de l’aptitude des animaux à être transportés.
Modèle 2
Certificat sanitaire pour les animaux des espèces
porcines de boucherie(1) / d’élevage(1) / de rente(1)
Etat membre d’origine: Grand-Duché de Luxembourg
Numéro du certificat(4)
SECTION A
Nom et adresse de l’expéditeur:
.…………………………………..........................................................................................
.…………………………………..........................................................................................
Nom et adresse de l’exploitation d’origine:
…..………………………………............................
...................................................................……………………………………………….....(2)
Numéro d’enregistrement du négociant:............................……………………………….....
..................................................................…………………………………………….........(3)
Adresse et numéro d’agrément du centre de rassemblement dans l’Etat membre
d’origine (1) ou de transit(1)
…………........................................…………………………………………………………......
...……….…………………………………….......................................................................(3)
...……….…………………………………….......................................................................(3)
Informations sanitaires:
Je certifie que chaque animal du lot décrit ci-après:
1.
provient d’une exploitation d’origine et d’une zone qui, conformément à la législation communautaire ou nationale, ne font l’objet d’aucune interdiction ou limitation liée à des maladies animales touchant les espèces porcines;
2.(1)
est un animal d’élevage(1) ou de rente(1) qui a séjourné, selon les informations
disponibles, dans l’exploitation d’origine au cours des trente derniers jours ou depuis sa naissance s’il est âgé de moins de trente jours et qu’aucun animal importé d’un pays tiers n’a été introduit dans cette exploitation au cours de cette période, à moins qu’il n’ait été complètement isolé des autres animaux de l’exploitation.
SECTION B
Description du lot
Date de départ:.....................................……….........................
Nombre total d’animaux:...................................………........…..
Identification de l’animal (des animaux):
Race
Date de naissance
Identification officielle
Utiliser si nécessaire une liste supplémentaire qui sera jointe, revêtue de la signature et du cachet du vétérinaire officiel ou agréé
Numéro d’agrément du transporteur (s’il est différent du transporteur figurant à la section C et/ou si la distance de transport est supérieure à 50 km):……………….........
Moyen de transport:............………........Numéro d’enregistrement:…….....……………...
Certification au titre des sections A et B
Cachet officiel
Lieu
Date
Signature(*)
Nom et qualité en lettres majuscules:
Adresse du vétérinaire qui signe le certificat:
(*) Les sections A et B du certificat doivent être revêtues du cachet et de la signature du vétérinaire officiel de l’exploitation d’origine si ce n’est pas le même que celui qui signe la section C
ou
elles doivent être signées par le vétérinaire agréé de l’exploitation d’origine lorsque l’Etat membre d’expédition a mis en place un système de réseaux de surveillance approuvé au titre de la décision ../../CE de la Commission
ou
elles doivent être signées par le vétérinaire officiel responsable du centre de rassemblement agréé à la date de départ des animaux.
SECTION C(6)
Nom et adresse du destinataire:
...........………………………………………….......................................................................
...........………………………………………….......................................................................
...........………………………………………….......................................................................
Nom et adresse de l’exploitation de destination: (compléter cette rubrique en lettres
d’imprimerie):
Nom: ..........................................…………................................
Rue: ..........................................................……….....................
Code postale:............ Etat membre:.........................................
Numéro d’agrément du transporteur (si la distance de transport est supérieure à 50 km)(7)
Moyens de transport: ....................... Numéro d’enregistrement ………………............
Après inspection réglementaire, je certifie que:
1.
les animaux décrits ci-dessus ont été inspectés le .............(date) dans les 24 heures précédant le départ prévu et n’ont présenté aucun signe clinique de maladie infectieuse ou contagieuse;
2.
l’exploitation d’origine et, le cas échéant, le centre de rassemblement agréé et la zone où ils sont situés ne font l’objet d’aucune interdiction ou limitation liée à des maladies animales touchant les espèces porcines conformément à la législation communautaire ou nationale;
3.
toutes les dispositions applicables de la directive 64/432/CEE du Conseil sont respectées;
4.(3)
les animaux ci-dessus sont conformes aux garanties additionnelles pour:
-
Maladie: ...................................................................
-
Conformément à la décision ../.../CE de la Commission;
5.
les animaux ne sont pas restés plus de six jours dans le centre de rassemblement agréé(3) ;
6.
au moment de l’inspection, les animaux indiqués ci-dessus étaient aptes à être transportés sur le trajet prévu, conformément aux dispositions du règlement (CE) no 1/2005
(8);
Certification au titre de la section C
Cachet officiel
Lieu
Date
Signature(*)
Nom et qualité en lettres majuscules:
Adresse du vétérinaire qui signe le certificat:
(*) La partie C du certificat doit être revêtue du cachet et de la signature du vétérinaire officiel de l’exploitation d’origine
ou
du centre de rassemblement agréé situé dans l’Etat membre d’origine
ou
du centre de rassemblement agréé situé dans l’Etat membre de transit lorsqu’il remplit le certificat d’expédition des animaux vers l’Etat membre de destination.
Informations supplémentaires:
1.Ce certificat doit être revêtu d’un cachet et d’une signature d’une couleur différente de celle utilisée pour l’impression.
2.Ce certificat est valable pendant dix jours à compter de la date de l’inspection sanitaire effectuée dans l’Etat membre d’origine et visée à la section C.
3.Les renseignements devant figurer sur ce certificat doivent être introduits dans le système ANIMO à la date d’émission du certificat et au plus tard dans les 24 heures suivant celle-ci.
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(1)
Biffer les mentions inutiles.
(2)
Ne s’applique pas lorsque les animaux sont originaires de plusieurs exploitations.
(3)
Biffer la mention inutile.
(4)
A compléter par le vétérinaire officiel de l’Etat membre d’origine.
(5)
A compléter par le vétérinaire officiel du centre de rassemblement agréé de l’Etat membre de transit.
(6)
Biffer si le certificat est utilisé pour le mouvement d’animaux dans l’Etat membre d’origine et que seules les sections A et B sont complétées et signées.
(7)
Biffer si le transporteur n’est pas différent de celui identifié à la section B.
(8)
Cette déclaration ne dispense pas les transporteurs des obligations qui leur incombent en vertu des dispositions communautaires en vigueur, notamment pour ce qui est de l’aptitude des animaux à être transportés.